[スポンサーリンク]

化学者のつぶやき

結晶構造に基づいた酵素機能の解明ーロバスタチン生合成に関わる還元酵素LovCー

[スポンサーリンク]

 

筆者が学部生の頃、タンパク質の結晶化は非常に難しいと授業で教わりました。

タンパク質の結晶化は職人技だ!と。

 

しかし、タンパク質の結晶化は年々簡便になってきています。また、最近の酵素工学の論文を見ていると、近い将来タンパク質の結晶構造は必須になるのでは?思います。

今回は、血液中のコレステロール値を低下させる薬としても有名なロバスタチンの生合成に関わるLovCという還元酵素についての論文を紹介します。この論文では、LovCの結晶、変異酵素の結晶、補酵素や基質との共結晶など様々な結晶を基に、反応機構、タンパク質間相互作用について議論しています。

 

’’Crystal structure and biochemical studies of the trans-acting polyketide enoyl reductase LovC from lovastatin biosynthesis’’

Brian D. Ames, Chi Nguyen, Joel Bruegger, Peter Smith, Wei Xu, Suzanne Ma, Emily Wong, Steven Wong, Xinkai Xie, Jesse W.-H. Li, John C. Vederas, Yi Tang and Shiou-Chuan Tsai

PNAS, 109 (28) 11144-11149(2012) DOI : 10.1073/pnas.1113029109

Lovastatinの生合成

2015-08-15_23-35-13

Lovastatinの生合成経路はきわめてシンプルです。

TypeI PKSであるLovBとEnoyl ReductaseであるLovCの主に二つの酵素でLovastatinの骨格を作りあげ、そこへ、LovFによって作られた側鎖がLovDにより縮合するというものです。

 

この生合成経路の中で注目すべき点は、LovBLovCによって触媒される反応です。

この二つの酵素について以下の2点が注目されていました。

 

  • LovBによって生合成されるnonaketide中間体は8つのケト部分構造を持つのに、なぜLovCはそのうちの3つのみを認識して還元できるのか?
  • LovBLovCはcomplexを形成しているのか?

 

enoyl reductaseって何?

type I PKSは、複数のドメインが一つのポリペプチド上に連なった酵素です。ドメインには、KS, DH, AT, ACP, KR, MT, ER, TEなどがあります。ERは、下記の反応式に示すように二重結合の還元反応を触媒するドメインです。

enoyl reductase.png

 

今回取り上げるER(LovC)は、type I PKS (LovB)のポリペプチド上に無く、LovBとは別のタンパク質として存在しているにも関わらず、LovBのいくつかのモジュールの反応に関与しています。このようにモジュールの外側に存在しているにもかかわらず、反応に関わってくるものをtrans-actingと言います。trans ER以外に、trans ATなどもよく知られています。

 

LovCの構造

 

LovCはmedium-chain dehydrogenase/reductase(MDR) super familyというタンパク質群に属しています。ほぼ全てのMDRがdimerなのに対して、LovCはmonomerとして存在しています。

また、他のMDRに比べてLovCは、余分な領域を持っておいます。(上図A中のxL1xL2

このように、LovCはMDR super familyに属する他のタンパク質の構造と大きく異なっているため、分子置換法により結晶構造を解くことはできなかったようです。(今回の論文では、重原子置換法を用いています。)おそらく、ホモロジーモデルも作れなかったのではないでしょうか。

 

また、LovCは基質の結合の有無によりopen formclosed formをとります。NADPHが結合している状態ではopen form。ここにさらに基質が結合するとTyr296(xL2部分)が内側に倒れて、closed formになります。open formからclosed formに変化することによって、タンパク質表面の電荷状態も大幅に変化するようです。

 

LovBとLovCのタンパク質間相互作用

 

LovBとLovCのタンパク質間相互作用は昔から提唱されていました。しかし、どのように複合体を形成しているかは謎でした。今回、筆者らは、サイズ排除クロマトグラフィーでLovBとLovCが複合体を形成していることをまず確かめました。

size exclusion chromatograpy.gif

 

LovBには、機能していないERドメインが一つあります。この事実と、LovCはMDR super familiyに属しているにも関わらずmonomerで存在しているということ、LovCとLovBのERドメインの相同性が高いことより、

LovCはLovBのERドメインとhetero dimerを形成しているのではないか?

LovCがmonomerで存在しているのはhetero dimerを作るためでは無いのか?

と論文著者らは予想しました。

 

そこで、LovBのERドメインのみをクローニングしてタンパク質を精製し、サイズ排除クロマトグラフィーで相互作用を調べましたが、LovCとはhetero dimerを形成しませんでした。

 

論文著者らは、LovCとLovBのタンパク質間相互作用にはER以外のドメインも関わっているのではないかと考えました。そこで、LovBのホモロジーモデルとLovCの結晶構造とでドッキングシミュレーションを行なうと、LovBのACPドメインとLovCが非常に近い位置にあることが分かりました。

LovB ACP-LovC.gif

上図左側が、LovBのACPドメインのホモロジーモデル。右側がLovCと基質の共結晶。タンパク質の表面電荷からもLovCのactive siteとLovBのACPドメインは相互作用することが裏付けられています。

結論として、LovCはLovBのACPドメイン、ERドメインと相互作用しています。

 

LovCの反応機構

今回の実験結果よりLovCの反応機構は以下の図のように推定されました。(細かい実験結果は、論文を参照してください)

2015-08-15_23-39-24

 

 

1. 基質が結合する前に、NADPHがLovCに結合する。

2. これによりLovCの構造が変化しLovBと結合しやすくなる。

3. LovBのACPドメインがLovCのK54付近の正電荷を帯びているタンパク表面と相互作用し、複合体を形成する。

4. 基質がACPよりLovCに受け渡される。

5. NADPHのヒドリドが基質のC3位を攻撃。

6. 中間体であるエノラートがLovC中のオキシアニオンホールにより安定化される。

7. 基質のC2が水の水素原子を奪い、還元反応が終了する。

8. LovCから基質が放出され、LovBとの複合体形成を解消する。

 

 

また、論文著者達はドッキングシミュレーションによりLovCの基質特異性についても議論しています。

実験結果より、LovCが受け入れることができるのは、tetraketide, pentaketide, heptaketideのみです。他のpolyketide中間体はなぜ受け入れられないのでしょうか?その理由は以下のように述べられています。

diketideやtriketideのような炭素鎖の短い基質では、NADPHと基質の二重結合部分がうまく近づかない。

また、hexaketideでは、LovCの反応よりもDiels Alder反応の方が優先される。

heptaketideよりも長い炭素鎖の基質は、酵素のキャビティ容積の関係上、キャビティ内に入らない。

 

今回の研究の位置づけ

LovBとLovCのタンパク質間相互作用は、Vederas本人によって30年以上前に提唱されていましたが、今回の論文で初めて証明されました。やはり、タンパク質の結晶構造には説得力があります。

 

今回紹介した論文はPNASに掲載された論文でした。Vederas, Yi-Tang, Tsaiの3研究室合同の研究ということもあり、データ量、内容ともに充実したものでした。明らかに、PNASより上の雑誌を狙って失敗したという印象を受けました。(量が多すぎたので、今回のつぶやきの記事では、論文のかなりの部分を省略して紹介しました。結果としてまとまりの無い記事になってしまいました。)

今回の論文で、より上の雑誌を目指すために足りなかったのは、変異実験についての考察だと思います。あるアミノ酸残基を変えることに酵素の機能がガラッと変化すれば結論付けが楽なのですが、今回の論文中の変異実験の結果はどれも微妙なものでした。

 

今回、LovCの構造が明らかになったことでLovBのACPとの相互作用部位などが分かりました。LovCの配列を用いてBLAST検索することにより他のカビのtrans-acting ERも見つけることができるようになりました。そこからさらに、trans acting ERと相互作用するType I PKSを見つけ出すことも可能になりました。

つまり、今回の論文の成果は、ロバスタチンの生合成研究にのみ還元されるものではなく、その他多くのカビの代謝産物の研究にとって重要なものです。今後のカビの二次代謝産物の生合成研究に多いに貢献すると思います。

 

最後に

今回紹介したような酵素を論文で見るたびに、生体の反応制御の精巧さに驚かされます。酵素活性部位を模倣した触媒というものが、多数開発されていますが、まだ酵素には及ばないように思います。酵素の反応制御のすごさと言うのは、活性中心のみだけでなく、それ以外の部分にも現れています。

タンパク質間相互作用により、他の酵素との基質のやり取りを容易にしたり、基質の結合によりopen form, closed formを切り替えたりと、本当に良くできていると毎度感嘆させられます。

 

関連書籍

[amazonjs asin=”4254177151″ locale=”JP” title=”代謝と生合成30講 (図説生物学30講 植物編)”]
Avatar photo

ゼロ

投稿者の記事一覧

女の子。研究所勤務。趣味は読書とハイキング ♪
ハンドルネームは村上龍の「愛と幻想のファシズム」の登場人物にちなんでま〜す。5 分後の世界、ヒュウガ・ウイルスも好き!

関連記事

  1. サイエンスアゴラ2015総括
  2. アズレンの蒼い旅路
  3. 科学雑誌 Newton 2019年6月号は化学特集!
  4. Stephacidin Bの全合成と触媒的ヒドロアミノアルキル化…
  5. 光触媒でエステルを多電子還元する
  6. 生きたカタツムリで発電
  7. アラインをパズルのピースのように繋げる!
  8. 第三回ケムステVシンポ「若手化学者、海外経験を語る」開催報告

注目情報

ピックアップ記事

  1. ハーバード大Whitesides教授プリーストリーメダルを受賞
  2. 沖縄科学技術大学院大学(OIST) 教員公募
  3. 広がる産総研の連携拠点
  4. キラルシリカを“微小らせん石英セル”として利用した円偏光発光制御技術の開発
  5. 酸窒化物合成の最前線:低温合成法の開発
  6. 肝はメチル基!? ロルカセリン
  7. 合成化学の”バイブル”を手に入れよう
  8. 化学系企業の採用活動 ~現場の研究員視点で見ると~
  9. ドウド・ベックウィズ環拡大反応 Dowd-Beckwith Ring Expansion
  10. 第43回―「均質ナノ粒子の合成と生命医学・触媒への応用」Taeghwan Hyeon教授

関連商品

ケムステYoutube

ケムステSlack

月別アーカイブ

2012年8月
 12345
6789101112
13141516171819
20212223242526
2728293031  

注目情報

最新記事

理研の研究者が考える未来のバイオ技術とは?

bergです。昨今、環境問題や資源問題の関心の高まりから人工酵素や微生物を利用した化学合成やバイオテ…

水を含み湿度に応答するラメラ構造ポリマー材料の開発

第651回のスポットライトリサーチは、京都大学大学院工学研究科(大内研究室)の堀池優貴 さんにお願い…

第57回有機金属若手の会 夏の学校

案内:今年度も、有機金属若手の会夏の学校を2泊3日の合宿形式で開催します。有機金…

高用量ビタミンB12がALSに治療効果を発揮する。しかし流通問題も。

2024年11月20日、エーザイ株式会社は、筋萎縮性側索硬化症用剤「ロゼバラミン…

第23回次世代を担う有機化学シンポジウム

「若手研究者が口頭発表する機会や自由闊達にディスカッションする場を増やし、若手の研究活動をエンカレッ…

ペロブスカイト太陽電池開発におけるマテリアルズ・インフォマティクスの活用

持続可能な社会の実現に向けて、太陽電池は太陽光発電における中心的な要素として注目…

有機合成化学協会誌2025年3月号:チェーンウォーキング・カルコゲン結合・有機電解反応・ロタキサン・配位重合

有機合成化学協会が発行する有機合成化学協会誌、2025年3月号がオンラインで公開されています!…

CIPイノベーション共創プログラム「未来の医療を支えるバイオベンチャーの新たな戦略」

日本化学会第105春季年会(2025)で開催されるシンポジウムの一つに、CIPセッション「未来の医療…

OIST Science Challenge 2025 に参加しました

2025年3月15日から22日にかけて沖縄科学技術大学院大学 (OIST) にて開催された Scie…

ペーパークラフトで MOFをつくる

第650回のスポットライトリサーチには、化学コミュニケーション賞2024を受賞された、岡山理科大学 …

実験器具・用品を試してみたシリーズ

スポットライトリサーチムービー